Обзор научных статей и данных различных исследований по теме
«инсулин и проинсулин».

1. Секреция проинсулина в течение первых трех лет после установления диагноза у больных сахарным диабетом с наличием и без наличия антител к островковым клеткам.
      Журнал: Diabetes care, volume 19, № 6, июнь 1996 год, страница 659.
      Авторы: A. Gottsater, D.R. Owens, S. Luzio, G. Sundkvist.
      Цель – ценить секрецию проинсулина при различных типах NIDDM (сахарного диабета 2-го типа).
      Методы исследования – производилась оценка уровня проинсулина и инсулина при установлении диагноза сахарный диабет и спустя 3 года (определение проводилось натощак и после нагрузки глюкозой и глюкагоном, вводимых внутривенно) у 10 пациентов с NIDDM без антител к островковым клеткам при установлении диагноза (возраст больных в среднем 52±4 года), у 11 NIDDM пациентов с антителами к островковым клеткам на момент установления диагноза (средний возраст пациентов 50±5 лет), и 21-го здорового человека (средний возраст 53±4 года).
      Результаты: При установлении диагноза уровень проинсулина натощак был выше у пациентов с NIDDM без антител к островковым клеткам, чем у людей из контрольной группы (39,6±10,0 пмоль/л против 12,8±1,6 пмоль/л, р<0,01). После нагрузки глюкозой, вводимой внутривенно, уровень проинсулина у больных с NIDDM и с антителами к островковым клеткам снизился с 35,6±6,2 пмоль/л до 13,5±5,4 пмоль/л, (р<0,05), а у пациентов с NIDDM без наличия антител к островковым клеткам остался на прежнем уровне. По прошествии 3-х лет с момента установления диагноза сахарного диабета уровень проинсулина натощак (10,0 ± 3,7 пмоль/л против 59,1±17,0 пмоль/л) и уровень проинсулина после нагрузки глюкозой внутривенно (13,5 ± 5,4 пмоль/л против 103,9±35,1 пмоль/л), а после нагрузки глюкагоном внутривенно (7,4±3,9 пмоль/л против 36,0±7,7 пмоль/л) показатели уровня проинсулина были намного ниже (р<0,01) у пациентов с NIDDM с наличием антител к островковым клеткам, чем у пациентов с NIDDM без антител.
      Вывод: После выявления диабета секреция проинсулина значительно снижается у пациентов с NIDDM с антителами к островковым клеткам и остается неизменным у пациентов с NIDDM без антител.

2. Выращивание взрослых человеческих островковых препаратов с фактором роста клеток печени и 804 G матриксе, являющихся митогенетическими для протоковых клеток, но не для В-клеток.
      Журнал "Diabetes", январь 1998 года, № 1, volume 47.
      Недавно было сообщено, что зрелые человеческие В-клетки размножались во время выращивания экстраклеточного матрикса из 804 G клеток крысы и при факторе роста клеток печени. Данное исследование позволяет сравнить митогенетическое действие на человеческие В-клетки и на соседние неэндокринные каналовые клетки. Частицы, обогащенные островковыми клетками, были подготовлены из донорских органов взрослого человека и обработаны в суспензии или на 804 G матриксе с фактором роста клеток печени и без него. Сочетание 804 G матрикса и фактора роста клеток печени (ФРКП) увеличено количество 5-бром-2-деоксиуридин положительных клеток (BrdU+) в течение 48 часов, достигая максимума после 4-х дней. В секциях все BrdU+ клетки были отрицательными (нечувствительными) для инсулина или глюкагона и для препроинсулиновых мРНК, но выразили производителей каналовых клеток цитокератин 19 и 7, углеродный ангидрид-II и углеводный антиген 19-9.
      После 4-х дней выращивания канальные клетки цитокератин 19+ показали BrdU-маркированный индекс 30% (р<0,01) против 2% без ФРКП и матрикса, несмотря на то, что было маркировано менее 0,1% инсулин-позитивных и менее 1% глюкагон-позитивных клеток.
      Образование двух слоев с каналовыми клетками может вызвать ложное толкование двойной положительности в несекционной ткани. Был сделан вывод о том, что выращивание человеческих островковых клеток с ФРКП и 804 G матриксом стимулирует размножение каналовых клеток, но не основных В-клеток.

3. Не полное высвобождение обработанного проинсулина – причина латентной (непропорциональности) проинсулинемии у больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД).
      Журнал "Diabetes", ноябрь 1997 года, № 11, volume 46.
      Авторы: Steven E. Kahn, Philippe A. Halban.
      Продуцирование инсулина из проинсулина включает расщепление неповрежденного проинсулина на полупродукты проинсулина путем обработки энзимов РС2 и РС3 перед тем, как выработается полностью обработанный инсулин. Неповрежденный проинсулин и эти полупродукты измеряются во многих опытах с иммунореагирующим (иммунореактивным) инсулином (ИРИ). Уровень базового ИРИ, полученного из проинсулин (ПИ) подобных молекул (ПИ/ИРИ) повышен у больных с сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД). Пока не установлено стимулированные уровни ИРИ соответствуют повышенному уровню ПИ/ИРИ или увеличились какие либо полупродукты проинсулина и/или их соотношения. Показатель активности выработки проинсулина в В-клетке поджелудочной железы может быть определен путем измерения ПИ/ИРИ, который происходит сразу же за стимулированной секрецией В-клеток и затем определяется количеством неповрежденного проинсулина и его полупродуктами.
      В этом исследовании мы определили уровни ПИ/ИРИ в условиях без нагрузки и в стимулированных аргинином состояниях у 17-ти здоровых людей, а также у 16 пациентов, страдающих сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД). Также была проведена высокоэффективная жидкая хромотография для измерения относительного количества неповрежденного проинсулина и его полупродуктов ко всем проинсулин-подобным молекулам. У больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД) как начальный (44,6±9,6 пмоль/л против 9,3±1,5 пмоль/л; р<0,001) и стимулированный (64,0±12,7 пмоль/л против 19,8±2,8 пмоль/л; р<0,001) уровни проинсулин-подобных молекул были выше, чем у здоровых людей. Хотя ИРИ был выше у больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД), чем у здоровых людей из контрольной группы в условиях без нагрузки (106±19 пмоль/л против 65,1±8,1 пмоль/л; р<0,05), уровень его был ниже у больных он был ниже у больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД), чем у людей из контрольной группы после стимуляции (возрастание составило 257±46 пмоль/л против 416± пмоль/л; р<0,03).
      Отношение ПИ/ИРИ увеличилось у больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД) в начальных и стимулированных условиях в сочетанием с высвобождением непропорционально увеличенного количества проинсулин-подобных продуктов. Результаты, определённые с помощью высокоэффективной жидкой хромотографии показали, что в стимулированном состоянии неповрежденный проинсулин состоит из 40,1±6,7% проинсулин-подобных молекул у больных сахарным диабетом 2-го типа (ИНХСД) и 30,1± у здоровых людей. Остаток проинсулинподобных молекул составил дез-31,32-расщепленный полупродукт проинсулина. Рост ПИ/ИРИ у больных СД 2-го типа (ИНЗСД) в начальных и, особенно, стимулированных состояниях заставляет предположить, что на самом деле имеет место нарушение расщепления проинсулина при настоящем расстройстве. Так как относительные количества неповрежденного инсулина и дез-31,32-расщепленного проинсулина одинаковы у здоровых людей и больных страдающих сахарным диабетом 2-го типа, можно предположить, что проинсулин расщепляется на две составные части. Как бы то ни было, во время экзоцита (выделения), секреторные гранулы в островковой клетке у больных СД 2-го типа (ИНЗСД) содержат большее количество не полностью обработанного (расщепленного инсулина) проинсулина.

4. Соотношение проинсулина и инсулина и соотношение проинсулина к инсулину, к чувствительности к инсулину и действие инсулина у людей с нормогликемией.
      Журнал "Diabetes", декабрь 1997 года, № 12, volume 46.
      Авторы: Leena Mykkgnen, C. Nick Hales, Steven M. Haffner Tapani Rynnemaa, Markku Laakso
      Уровни проинсулина в плазме крови и уровень содержания его полупродуктов повышены у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа (ИНЗСД). Недавние исследования показали, что уровень содержания проинсулина в плазме крови выше к уровню инсулина у тех людей, которым в последствии был поставлен диагноз сахарного диабета 2-го типа (ИНЗСД). Это возникает в результате инсулинорезистентности или в результате дефекта в процессе синтеза и катаболизма проинсулина и инсулина. Если инсулинорезистентность является пусковым механизмом, то соответственно соотношение проинсулина к инсулину будет выше у людей с инсулинорезистентностью, чем у людей с сохраненной чувствительностью к инсулину. Мы изучили взаимосвязь содержания проинсулина натощак, 32,33-расщепленного проинсулина и соотношения проинсулина и инсулина с чувствительностью к инсулину при внутривенной нагрузкой глюкозой. Также мы исследовали отношение проинсулина к инсулину и соотношение проинсулина к инсулину.
      В заключение: инсулинорезистентность у людей с нормогликемией была связана, скорее с низким, чем с высоким соотношением уровня проинсулина к инсулину. Люди, у которых сохранялась нормогликемия со слабой чувствительностью к инсулину, имели более высокое соотношение проинсулина к инсулину по сравнению с теми, у кого была более сильная секреция инсулина, необходимая для поддержания нормогликемии. Эти результаты дают возможность предположить, что у людей с нормальной резистентностью к глюкозе инсулинорезистентность не вызывает увеличенный синтез проинсулина по отношению к секреции инсулина, но связана с усовершенствованным катаболизмом (обработкой) проинсулина.

5. Высший проинсулин и специфический инсулин связаны с источником возникновения диабета у мексиканцев, не страдающих диабетом.
      Журнал "Diabetes", октябрь 1995 года, № 10, volume 44, стр. 1156-1160.
      Авторы: Steven M. Haffner, Ronald Gingerick, Mihael P. Stern, Ronald R. Bowsher, Heikki Miettinen.
      Предполагается, что инсулинорезистентность и сниженная секреция инсулина являются предвестником развития инсулинонезависимого сахарного диабета. Повышенная концентрация проинсулина отражает ненормальную обработку проинсулина (метаболизм проинсулина) и может указывать на сниженную секрецию инсулина.
      Мы определили уровень инсулина натощак, предполагая, что это является причиной инсулинорезистентности, и определили уровень проинсулина и отношения проинсулина к инсулину натощак в качестве причины замедленного процесса обработки проинсулина у 597 мексиканцев, не страдающих сахарным диабетом. Исследования проводились в San Antonio Heart Study. Инсулин, проинсулин и отношение проинсулина к инсулину натощак были выше у людей с предрасположенностью к сахарному диабету, чем у людей, не имеющих данной предрасположенности. Этот фактор становился еще более значительным при наличии у пациентов таких факторов как ожирение и нарушение толерантности к глюкозе. Предрасположенность к сахарному диабету у мексиканцев, не страдающих сахарным диабетом, связана с ростом специфического инсулина натощак и непропорциональному росту проинсулина относительно инсулина. Эти данные дают возможность предположить, что и увеличение инсулинорезистентности и нарушение метаболизма проинсулина встречается у детей тех родителей, которые страдают сахарным диабетом.
      Усиление секреции проинсулина связано с деструкцией В-клеток.
      Предполагают, что гиперпроинсулинемия является предвестником прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (НТГ) в сторону сахарного диабета 2-го типа. В настоящем исследовании сравнивали концентрации инсулина (И), С-пептида (С) и проинсулина (ПИ) у здоровых пациентов (n=14, 1-ая группа), больных сахарным диабетом 2-го типа (n=20, 2-ая группа) и больных с НТГ (n=20, 3-я группа) во время теста на толерантность к глюкозе. Кроме этого определяли отношение ПИ/И и сравнивали площади под кривой изменения концентрации ПИ во время теста. Не было найдено существенных различий между группами в уровне базального ПИ и его концентрации через 30 минут от начала теста. Однако у больных 3-ей группы площадь под кривой ПИ была выше, чем в других группах (105,3±47,3 по сравнению с 69,0±20,6; 45,3±20,8 пМ/л/час). Базальные значения отношения ПИ/И и постнагрузочные значения ПИ/И во всех группах существенно не отличались. У больных 3-ей группы при нагрузке глюкозой ответ ПИ развивался быстро и нарастал, у больных 2-ой группы ответ ПИ быстро заканчивался (притуплялся). Было сделано предположение, что дисфункция В-клеток предшествует клиническим проявлениям сахарного диабета и гиперпроинсулинемии, и что изменения ответа ПИ при тесте на толерантность к глюкозе может являться показателем развивающегося сахарного диабета 2-го типа.
      В последних исследованиях показано, что С-пептид проинсулина обладает микроваскулярным эффектом за счет активации эндотелиальной нейроксидсинтетазы (NO-синтетазы). Исследовали влияние С-пептид проинсулина на способность эритроцитов изменять форму у больных сахарным диабетом 1-го типа. Пробы цельной крови 20-ти здоровых людей и 30 пациентов с сахарным диабетом 1-го типа практически с нормогликемией инкубировали в средах с различными концентрациями человеческого С-пептид проинсулина (0,6-66нМ). Изменение формы эритроцитов определяли на лазерном дифрактоскопе при 0,1-30 паскалях. Индекс удлинения Е, который коррелирует с деформацией эритроцитов, у больных сахарным диабетом был существенно ниже по сравнению с контролем на всем протяжении измерений. осле обработки проб крови С-пептид проинсулина в концентрации 0,6; 6,6 или 6 нМ деформируемость эритроцитов у больных сахарным диабетом не отличалась от контрольной группы. С-пептид проинсулина не оказывал какого-либо влияния на деформируемость эритроцитов здоровых людей. Инкубация с контрольными пептидами не изменяла индекс удлинения. Влияние С-пептида проинсулина на деформируемость эритроцитов у больных сахарным диабетом 1-го типа полностью снималась в присутствии оуабаина. Было сделано заключение, что в действие С-пептид проинсулина на эритроциты больных сахарным диабетом 1-го типа вовлечена эритроцитарная N,K-АТФаза.
      Ранее было показано, что у потомков больных инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД) без ожирения и не страдающих диабетом более часто встречаются нарушения секреции инсулина (И), чем резистентность к инсулину. У 74 потомков, родители которых больны ИНСД (средний возраст около 42,5 лет, ИМТ=23,7 кг/м*м) сравнивали натощак уровни интактного проинсулина (ПИ), И, отношение ПИ/И, отношение С-пептида/И как показатель печеночного клиренса, с чувствительностью к инсулину и секрецией И. Контролем служили одинаковые по возрасту и весу 23 здоровых пациента. Секрецию инсулина определяли как одномоментный ответ инсулина на глюкозу (I), а чувствительность к инсулину (II) как минимальное изменение сенситивного индекса (S1) при использовании модифицированного внутривенного глюкозотолерантного теста. При оральном глюкозотолерантном тесте 57 пациентов имели нормальную толерантность к глюкозе, у 17-ти пациентов было нарушение толерантности к глюкозе. У тех и у других одномоментный ответ на глюкозу и чувствительность к инсулину были значительно ниже, чем в контроле. Различий в концентрации натощак ПИ, С-пептида, ПИ/И, и С-пептида/И между исследуемыми группами и контролем не наблюдалось. Для тощаковых ПИ, И, С-пептид/И была обнаружена обратная зависимость с чувствительностью к инсулину, концентрация И натощак прямо пропорционально коррелировала с одномоментным ответом инсулина на глюкозу. Эти зависимости, однако, исчезали при учете возраста, ИМТ и отношения окружности талии к окружности бедер. Сделано заключение, что у потомков больных ИНСД, не страдающих сахарны диабетом, может не быть изменений в секреции ПИ и печеночном клиренсе инсулина, даже если у них наблюдается нарушение секреции инсулина.

6. Зависимость между высоким содержанием проинсулина и удельной активностью инсулина и наличием сахарного диабета у родителей американцев мексиканского происхождения.
      Авторы: Steven M. Haffner, Michael P. Stern, Heikki Miettinen, Ronald Gingerch, and Ronald R. Bowsher.
      Полагают, что резистентность к инсулину (И) и снижение секреции И являются предвестниками инсулиннезависимого сахарного диабета (ИНСД). Повышение концентрации проинсулина (ПИ) отражает нарушение процессинга (обработки, превращения) ПИ и может свидетельствовать о нарушении секреции инсулина. У 597 американцев мексиканского происхождения не страдающих сахарным диабетом определяли концентрацию И натощак (радиоиммунным методом), как показатель резистентности, И, ПИ и отношение ПИ/И – как показатель нарушения процессинга ПИ. У пациентов, родители которых страдали сахарным диабетом, концентрации И натощак, ПИ и ПИ_И были выше, чем у тех пациентов, чьи родители не болели сахарным диабетом. Эти различия оставались достоверными даже после внесения поправок на наличие ожирения, распределения жира и наличия толерантности к глюкозе. Наличие в родословной сахарного диабета связано с увеличением концентрации И натощак и диспропорциональным увеличением концентрации ПИ по отношению к И. Сделали заключение, что у потомков больных сахарным диабетом, не страдающих диабетом, наблюдается увеличение резистентности к инсулину и нарушение процессинга ПИ.

7. Трансгенная экспрессия мышиного проинсулина 2 предотвращает развитие диабета у мышей с диабетом и без ожирения.
      Авторы: Michelle B. French, Janett Allison, David S. Cram, Helen E. Thomas, Majella Dampsey-Collier, Anabel Silva, Harry M. Georgiou, Thomas W. Kay, Leonard C. Harrison, Andrew M. Lew.
      Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД) у людей и у мышей с диабетом и без ожирения (NOD) является зависимым от Т-клеток аутоиммунным заболеванием, при котором нарушается функция В-клеток. Идентифицированы несколько предположительных аутоантигенов В-клеток, но инсулин и проинсулин являются единственно строго специфичными для В-клеток. Вероятно, проинсулин является ключевым аутоантигеном при ИЗСД. С целью исследования роли проинсулина в развитие ИЗСД вывели NOD – мышей трансгенных по мышиному гену проинсулина 2, что обеспечивало уничтожение происулин-реактивных Т-клеток. У трансгенных NOD – мышей почти полностью отсутствовала инфильтрация островков мононуклеарами (инсулит) и диабет не развивался. В слюнных железах продолжала обнаруживаться инфильтрация мононуклеарами (сиалит) и сохранился иммунный ответ на введение овальбумина, что указывает на специфичность защитного эффекта введения трансгена и отсутствие генерализованной иммуносупрессии. Сделали заключение, что аутоиммунность к проинсулину имеет кардинальное значение в развитие ИЗСД.

8. Регуляция функции Я-клеток in vivo.
      Авторы: Steven E. Kahn, MB,CHB.
      Секреция инсулина является сложным процессом, возникающим в ответ на действие глюкозы и других средств, усиливающих секрецию, и модулируется такими факторами как чувствительность к инсулину. При инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНЗСД) имеет место нарушение секреторной функции Я-клеток, что является основной причиной развития гипергликемии. Нарушение функции Я-клеток при ИНЗСД включает: снижение способности глюкозы стимулировать секрецию инсулина, снижение способности глюкозы модулировать секрецию инсулина на другие стимулы и утрату колебательного (осциллярного) характера освобождения инсулина. Инсулин синтезируется из «большого» предшественника – проинсулина. У здоровых людей небольшое количество проинсулина высвобождается из Я-клеток и циркулирует в плазме; у больных ИНЗСД нарушение процессинга (превращения) проинсулина приводит к увеличению количества циркулирующего проинсулина. Схожие, но менее выраженные изменения функции Я-клеток наблюдаются у пациентов с высоким риском развития ИНЗСД. Патогенез нарушения функции Я-клеток до конца не ясен и частично может быть связан с отложением амилоида в островках у больных ИНЗСД. Островковый амилоид содержит амилоидный полипептид, который синтезируется в Я-клетках и секретируется клетками совместно с инсулином. В настоящем обзоре собраны данные исследований на людях о нормальной функции Я-клеток и изменениях, происходящих при развитии ИНЗСД.

9. Ген человеческой прогормональной конвертазы 3.
      Авторы: Shinya Ohagi, Hidenoba Sakaguchi, Tokio Sanke, Hitomi Tatsuta, Tadashi Hanabusa, and Kishio Nanjo.
      Проинсулин превращается в инсулин при совместном действии 2-х специфических протеаз: прогормональной конвертазы 2 (ПГ 2) и прогормональной конвертазы 3 (ПГ 3). ПГ 3 – это проинсулин-превращающий фермент 1-го типа, который инициирует последовательный процессинг (превращение) проинсулина в инсулин за счет разрывания молекулы проинсулина на СООН-терминальном конце двух-основного пептида, Arg 31-Arg 32, соединяющего В-цепь и С-пептид. Поэтому понятна ключевая роль ПГ 3 в регуляции биосинтеза инсулина. Экспрессия инсулина и ПГ 3, но не ПГ 2, координировано регулируется глюкозой. При инсулиннезависимом сахарном диабете наблюдается усиление секреции проинсулина и проинсулинподобных молекул, что позволяет предполагать наличие мутации гена ПГ 3. Для выяснения этого предположения выделили и охарактеризовали ген ПГ 3 у группы больных ИНЗСД японского происхождения. Ген ПГ 3 состоит из 14 экзонов, занимающих более 35 кв. Организация (устройство) экзон-интронов в генах ПГ 2 и ПГ 3 консервативно и соответствует обычному эволюционному строению семейства генов прогормональных конвертаз.
      Конформоционный анализ и секвенорование кодирующих участков гена ПГ 3 у 102 японцев с ИНЗСД выявили наличие миссенс-мутаций (мутации с изменением смысла) в экзоне 2 (Arg/Gln 53) и и14 (Gln/Glu 638), которые не связаны с наличием сахарного диабета в популяции.
      Эти данные показали, что генетические изменения гена ПГ 3 вряд ли являются основной причиной ИНЗСД у японцев.
      Все больше появляется данных, свидетельствующих, что периферические белки, включая связанные с инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) аутоантигены к инсулину, GAD, IA – 2, экспрессируются в тимусе за счет автономной, эктопической транскрипции/трансляции соответствующих генов. Влияние аллелей ИЗСД 2 на уровень м-РНК инсулина в тимусе и исследования на трансгенных мышах дали доказательства связи экспрессии периферических белков в тимусе с развитием иммунологической собственной толерантности (аутотолерантности). Периферические белки экспрессируются в тимусе РАЕ-клетками. В тимусе мышей РАЕ-клетки принадлежат к популяции отросчатых (дендритичных) макрофагальных клеток, но о РАЕ-клетках у людей до сих пор не было какой-либо информации. Показав ранее, что тимус людей содержит РАЕ-клетки экспрессирующие проинсулин, авторы в настоящей работе продемонстрировали наличие РАЕ-клеток экспрессирующих GAD и IA – 2.
      Кроме того, с помощью двойного окрашивания срезов тимуса людей привели доказательства того, что проинсулин-синтезирующие РАЕ-клетки включают в себя отростчатые клетки и макрофаги. Нашли, что РАЕ-клетки, экспрессирующие проинсулин, GAD и IA – 2, также можно обнаружить в периферических органах, таких как селезенка и лимфатические узлы. Считают, что в то время как экспрессия проинсулина в тимусе является ключевым моментом для возникновения толерантности в тимусе во время становления иммунного статуса в организме. Экспрессия проинсулина в периферических отделах иммунной системы, возможно, способствует поддержанию толерантности в течении дальнейшей жизни, после физиологической инволюции тимуса. Полученные данные проливают новый свет на механизмы развития аутоиммунной реакции при сахарном диабете 1-го типа.
      Исследовали влияние дифференциации клеток мишеней на эффективность (продуктивность) процессинга проинсулина, при котором место расщепления С-цепи в к-ДНК человеческого препроинсулина было таким образом изменено, чтобы экспрессировался преимущественно фурин. Модифицированную таким образом к-ДНК клонировали в вектор ретровируса и перенесли путем трансфекции в ТНР-1 моноциты и С2С12 миобласты. Эффективность процессинга проинсулина в инсулин (Ер%) определяли по отношению инсулин/инсулин +проинсулин в супернатанте спустя 48 часов после трансфекции. В недифференцированных моноцитах секреция инсулина составила 0,78 рМ, проинсулина 13,6 рМ, а Ер была ниже 5,7%. В дифференцированных макрофагах, дифференциацию которых стимулировали дюрбоновым эфиром (РМА 200мМ), секреция инсулина составила 5,97 рМ±, проинсулина 13,0 рМ±, Ер=30,3%. Кроме этого исследовали эффект степени дифференциации в другом типе клеток – миобластах С2С12, чью дифференциацию вызывали другими стимулами. В недифференцированных миобластах секреция инсулина – 0,040 рМ±, проинсулина менее 2,0 рМ±, Ер=1,90%. При дифференции миобластов в миотубулы: секреция инсулина – 8,84 Рм±, уровень проинсулина остался на том же уровне, Ер=81,5%. Нозерн-блот анализ показал, что существенное увеличение м-РНК фурина в дифференцированных макрофагах и миотубулах по сравнению с недифференцированными формами клеток.
      Данные исследования показали, что для эффективного процессинга проинсулина фурином и секреции полноценного инсулина необходима дифференциация клеток-мишеней, которая связана с индукцией экспрессии гена фурина.

10. Процессинг проинсулина фурином, прогормональная конвертаза 2 (ПГ 2) и прогормональная конвертаза № (ПГ 3) в (Со) котрасферных СОS клетках.
      Авторы: Florence Vollenweider, Joceline Kaufmann, Jean-Claude Irmiger, and Philippe A. Halban.
      Исследовали энзимологию конверсии проинсулина в COS-клетках путем котрансфекции 3-х типов проинсулина и каждой из 3-х эндопротеаз конверсии (фурина, ПГ 2 и ПГ 3).
      Наблюдали незначительную конверсию каждого из проинсулинов в COS-клетках без котрансфекции экзогенной эндопротеазы. Когда фурин или ПГ 3 были котрансфектированы с любым из 3-х проинсулинов, то наблюдали экстенсивный процессинг, при котором инсулин был основным продуктом конверсии. В противоположность этому ПГ 2 оказалась не способной расщеплять человеческий инсулин, но расщепляла человеческий проинсулин Arg 62 и крысиный проинсулин 2. Расщепление этих типов проинсулинов происходило преимущественно в месте соединения С-пептид – А-цепь, что приводило к образованию преимущественно проинсулина, как основного продукта, и очень небольшого количества собственно инсулина.
      Ранее было показано, что внутримышечная экспрессия плазмидной ДНК, VR-3502, кодирующей крысиный препроинсулин, обеспечивает постоянное освобождение проинсулина у мышей без диабета. Показали, что билатеральная инъекция 100 ug препроинсулиновой ДНК в m. Tibialis anterior в течении 2-х дней вызывает появление в среднем до 600 pg/ml гетерологичного инсулина на 1 миллилитр сыворотки, что соответствует базальному уровню инсулина в норме у грызунов. Цель настоящей работы – установить, способна ли инъекция плазмидной ДНК, экспрессирующая зрелый инсулин, обеспечить терапевтическое количество инсулина. Для этих целей использовали VR-3503, плазмидную ДНК, содержащую к-ДНК модифицированного крысиного препроинсулина, эндотелиазу и плазмиду, экспрессирующую мышиных фурин. VR-3505 котрансфекция мышиных миобластов или других не нейроэндокринных клеток этими плазмидами in vitro вызывала секрецию полноценного биологически активного инсулина. Используя вышеописанный метод, безтимусным мышам инъецировали ДНК, после чего спустя 4 дня ввели 200 мг/кг от веса тела стрептозоцин. Все животные, которым ввели контрольную ДНК (n=15) умерли через 8 дней после введения стрептозоцина. 56% (9 из 16) мышей, получивших VR3503 и VR-3505, жили на 6 дней дольше. Выжившим животным ввели повторную дозу коктейля из ДНК и 6 животных (38% от первоначальных 16-ти) жили 25 дней после введения стрептозотоцина, после этого эксперимент прекратили.
      Гистологический анализ выживших животных показал, что введение стрептозотоцина истощает 99,5% панкреатических островков (84 ng/ диабетическая железа, по сравнению с 22,5 ng/контрольная железа).
      При инъекции коктейля ДНК экспрессировалось 54-61 ng зрелого инсулина m. Tibialis anterior, в то время, как при инъекции контрольной ДНК инсулин не обнаруживался. Эти банные показывают, что гетерологичный инсулин, экспрессируемый в мышце, обеспечивает более длительное выживание мышей, получивших летальную дозу стрептозотоцина. Предполагают, что внутримышечная инъекция плазмиды, экспрессирующей инсулин, может являться терапевтическим методом обеспечения (доставки) базального уровня при сахарном диабете 1-го типа.
      Глюкоза стимулирует секрецию инсулина из внутриклеточных депо В-клеток. Эти депо вновь быстро пополняются за счет одновременного усиления биосинтеза проинсулина, так как глюкоза вызывает усиление трансляции предсуществующей препроинсулиновой м-РНК. В этом заключается специфический эффект глюкозы на биосинтез проинсулина, помимо влияния на общий белковый синтез в В-клетках, который действует на начальной стадии механизма трансляции. Молекулярный механизм специфической регуляции транскрипции биосинтеза проинсулина не известен, но вероятнее всего связан с регуляторными элементами нетранслируемых участков м-РНК препроинсулина. Для изучения роли различных участков м-РНК препроинсулина в регуляции глюкозой процесса трансляции использовали инфицированные рекомбинантные аденовирусом изолированные островки крыс. За счет введения полигистидиновой метки в препроинсулиновый ген2 крыс, стало возможным использовать роль5* и 3* нетранслируемых участков крысиной м-РНК препроинсулина с помощью экстракции на колонке с Ni (никелем) меченного проинсулинового белка.
      Далее описание метода и его возможностей.
      Результаты показали, что трансляция препроинсулинового участка 5* (5HisPI) регулируется в ответ на 60-ти минутное увеличение концентрации глюкозы одновременно с эндогенным проинсулином. В то же время 3* транслируемый участок (HisPI3) вел себя также как и контрольная м-РНК (HisPI) и общий синтез белка. Более того, дозозависимый от глюкозы ответ трансляции 5 HisPI м-РНК происходил параллельно эндогенной препроинсулиновой м-РНК. Полагают, что эти результаты указывают на то, что элементы 5* нетранслируемого участка препроинсулиновой м-РНК ответственны за специфическую регуляцию процесса трансляции м-РНК препроинсулина в ответ на глюкозу.

11. Проинсулин, интактный инсулин и фибролитическая изменчивость и фибриноген у здоровых людей.
      Авторы: Mats Eliasson, PHD, Michael E. Rinder, MD, Bo Dinesen, MSC, Per-Eric Evrin, PHD, Bernt Lindahl, MD.
      Так как высокий уровень инсулина предполагает ухудшение фибринолиза и так как проинсулин принимает участие в большинстве методик определения инсулина, авторы предположили, что проинсулин может определять ( обуславливать) низкую фибринолитическую активность и гиперинсулинемические состояния.
      У 165 здоровых мужчин и женщин (от 25 до 74 лет) исследовали зависимость между фибринолизом и фибриногеном плазмы и уровнем инсулина и проинсулина. Специфический инсулин и проинсулин определяли ферментативным иммуносорбентным методом. Вычисляли частные коэффициенты корреляции с учетом пола и возраста.
      Уровни фибриногена плазмы коррелируют с уровнем инсулина (р=0,25) и проинсулина ( р=0,29), а также имеется корреляция с активностью ингибитора активатора плазменогена-1 (р=0,36 и р=0.29).
      Активность активатора тканевого плазменогена (тПл) находилась в обратной зависимости по отношению к инсулину (р=20,35) и проинсулину (р=20,36). При мультивариантном анализе с учетом курения, антропометрических и метаболических данных, тощаковый проинсулин оказался выраженным индикатором высокого уровня фибриногена плазмы. Уровни инсулина и проинсулина не коррелировали с активностью тканевого плазминогена. Высокий уровень постнагрузочного инсулина, триглицеридов и диастолического давления крови, но не уровень проинсулина, чему предшествовала высокая активность ингибитора плазменогенного активатора-1.
      Заключение: В популяции здоровых людей ранее описанная зависимость между высоким уровнем инсулина и нарушением фибринолиза не имеет отношения к проинсулину. Увеличение уровня проинсулина связано с высоким уровнем фибриногена.

12. Культура человеческих островков с гепатоцитарным фактором роста и матриксом 804 G является митогенной для клеток протока, но не для Я-клеток.
      Авторы: Veronique H. Lefebvre, Timo Otonkoski, Jarkko Ustinov, Mari-Anne Huotari, Daniel G. Pipeleers, Luc Bouwens.
      Ранее было показано, что зрелые человеческие Я-клетки пролиферируют в культуре на внеклеточном матриксе, приготовленном из крысиных клеток 804 G и в присутствии гепатоцитарного фактора роста (ГФР). В настоящей работе сравнивают митогенный эффект этих условий на человеческие Я-клетки и на соседние неэндокринные клетки протока. Обогащенную фракцию островковых клеток получали из донорских органов человека и культивировали в суспензии или на матриксе из 804G с или без гепатицитарного фактора роста. Сочетание 804G-матрикса и гепатоцитарного фактора роста способствовало увеличению числа 5-бромо2*-деоксиуридин-положительных (БУ*) клеток в течении 48 часов, максимум достигается через 4 дня. На срезах практически во всех БУ*-клетках не обнаруживали инсулин или глюкагон и препроинсулиновую м-РНК, но они экспрессировали маркеры клеток протока цитокератин 19 и 7, карбонит ангидразу-2 и карбогидратный антиген 19-9. Через 4 дня в культуре, клетки протока положительные по цитокератину 19 имели индекс БУ-метки в 30% (р<0,01 по сравнению с 2% без гепатоцитарного фактора роста и матрикса), в то время как <0,1% инсулин-положительных и <1% глюкагон-положительных клеток метились. Образование двойного слоя из клеток протока, покрывающих эндокринные клетки, может приводить к ошибочной интерпретации усиления позитивности в ткани культуры, не приготовленной в виде срезов.
      Заключили, что культура клеток человеческих островков, приготовленных с гепатоцитарным фактором роста и на 804G-матриксе, стимулирует пролиферацию клеток протока, но не подлежащих Я-клеток.

13. Регулируемый глюкозой трансляционный контроль биосинтеза проинсулина эндопептидазами РС 2 и РС 3 в инсулин-продуцирующих клетках MIN6.
      Авторы: Robert H. Skelly, George T. Schuppin, Hisamitsu Ishihara, Yoshitomo Oka, and Christopher J.
      В короткий период ( менее 2 часов) биосинтез проинсулина преимущественно регулируется глюкозой на уровне трансляции; однако, детали этого молекулярного механизма не вполне ясны. Одним из препятствий для понимания механизма биосинтеза проинсулина является отсутствие достаточного количества В-клеток, обладающих способностью регулировать синтез проинсулина при колебаниях концентрации глюкозы имеющих место в нормальных панкреатических островках (2.816.7 ммоль/л).
      В настоящей работе показали, что клетки линии MIN6 обладают специфическим глюкозорегулируемым контролем синтеза проинсулина на уровне трансляции. Кроме того, в этих клетках синтез двух эндопептидаз проинсулина, РС 2 и РС 3 , также регулируется глюкозой, в то время как экзопептидазы, карбоксипептидаза Н не являются глюкозорегулируемыми. При концентрации глюкозы, превышающей 4 ммоль/л, синтез проинсулина, РС 2 и РС 3 активируется и достигает максимума при 8-10 ммоль/л. Глюкозостимулируемый синтез проинсулина, РС 2 и РС 3 происходит быстро ( возникает через 20 минут латентного периода, но не достигает максимума за 60 минут), на него не действует присутствие актиномицина Д; а стимулирующие концентрации глюкозы не изменяют общий уровень м-РНК препроинсулина, РС 2 и РС 3. Поэтому кратковременная (менее 2-х часов) стимуляция синтеза проинсулина, РС 2 и РС 3 в MIN6 клетках, как и в изолированных островках, опосредуется на уровне трансляции. Во внутриклеточной передаче сигнала, также как и в островках, существенная роль принадлежит протеинкиназе А. Протеинкиназа С или кальций зависимая протеинкиназа не является необходимым участником глюкозорегулируемого синтеза проинсулина в MIN6- клетках, также как и в островках. MIN6-клетки представляют первую линию В-клеток, обладающих регулируемым глюкозой синтезом проинсулина, идентичного проинсулину, "производимому" дифференцированными островковыми В-клетками, и является важной экспериментальной моделью для изучения деталей биосинтеза проинсулина.

14. Регуляция секреции инсулина вновь сконструированными генно-инженерными методами в линиях клеток инсулиномы.
      Авторы: Hans E. Hohmeier, Hector BentrandelRio. Samuel A. Clark, Rosemarie Henkel-Raeger, Karl Normington, Christopher B. Newgard.
      Описаны методы создания новой клеточной линии из клеток RIN 1046-38 крысиной инсулиномы путем стойкой трансфекции сочетания генов, кодирующих человеческий инсулин, GLUT 2 и глюкокиназы. Исследована регуляция секреции инсулина и метаболизма глюкозы в этой линии клеток. Линия клеток (ЯG I/17) экспрессирующая только трансген человеческого проинсулина проявляет четкое увеличение секреции базального инсулина ( измеренную в отсутствие стимуляции секреции) по сравнению с родительской линией клеток RIN 1046-38. Клетки ЯG I/17, сконструированные для высокого уровня экспрессии GLUT 2 и для двухкратного увеличения активности глюкокиназы (ЯG 49/206) или сконструированные только для 10-кратного увеличения активности глюкокиназы (ЯG-40/110) проявили 66% и 80% подавление базальной секреции инсулина по сравнению с ЯG I/17. В результате, клетки ЯG 49/206 и ЯG 40/110обладают инсулинсекреторным ответом только на глюкозу (6,1 и 7,6-кратно, соответственно) или на сочетание глюкоза + изобутилметилксантин (108 и 15,1-кратный ответ соответственно), что существенно больше, чем аналогичные ответы клеток ЯG I/17 или родительских RIN 1046-38. Клетки ЯG 49/206 и ЯG 40/110 также обладают быстрым и устойчивым ответом на глюкозу + изобутиметилксантин при их обработке (обрызгивании), причем значительно больше в количественном выражении про сравнению с контрольной линией. Исследования по дозазависимому ответу на глюкозу показали, что как генно-инженерные, так и негено-инженерные линии клеток отвечают максимально на сублимированные концентрации глюкозы, а клетки ЯG 49/206 наиболее чувствительны к низким концентрациям гексозы, что согласуется с более высоким потреблением ими меченной по тритию глюкозы. 5*-тиоглюкоза, потенциальный ингибитор гексокиназы с низким Km, наиболее эффективно нормализует глюкозозависимую секрецию инсулина в линии клеток с высокой экспрессией глюкозокиназы (ЯG 40/110). Сделали заключение, что GLUT 2 и/или экспрессия глюкозокиназы тесно связана с регуляцией базальной секреции инсулина в линиях клеток, с суперэкспрессией человеческого инсулина, что позволяет значительно улучшать степень секреторного ответа в такого рода клетках.

15. Секреция проинсулина в первые 3 года после постановки диагноза сахарный диабет у больных с наличием и отсутствием антител к клеткам островков.
      Авторы: A. Gottsater, MD,PHD, D.R. Owens, MRCP, MD, S. Lusio, PHD, G. Sundkvist, MD, PHD.
      Цель: Определить секрецию проинсулина при различных типах инсулиннезависимого сахарного диабета.
      Материалы и методы: у 10 больных инсулиннезависимого сахарного диабета без антител к островковым клеткам на момент постановки диагноза ( средний возраст 52±4 года) и у 11 больных с инсулиннезависимым сахарным диабетом с антителами на момент постановки диагноза ( средний возраст 50±2 года) и у 21 здоровых пациентов ( средний возраст 53±4 года) определяли уровень проинсулина и инсулина на момент постановки диагноза и спустя 3 года (натощак и после стимуляции внутривенным введением глюкозы и глюкагона).
      Результаты: При диагностике ИНСД концентрация тощакового проинсулина была выше у больных ИНСД без антител, чем в контроле (39,6±, и 12,8± пмоль/л соответственно). Ответ проинсулина на внутривенное введение глюкозы снизился у больных с наличием антител (с 35,6± до 13,5± пмоль/л), но остался неизменным у больных без наличия антител. Спустя 3 года концентрации проинсулина натощак (10,0± по сравнению с 59,1± пмоль/л), ответ на внутривенное введение глюкозы (13,5± по сравнению с 103,9± пмоль/л) и глюкагона (7,4± и 36,0± пмоль/л) были существенно ниже (р<0,01) у больных с наличием антител, по сравнению с больными без антител.

16. Связь случаев слепоты с сахарным диабетом (популяционное исследование).
      Christoph Trautner, MD, MPH, Andrea Icks, MD, MPH, Burhard Haastert, PHD, Frank Plum, MD, Michael Berger, MD.
      Уменьшение случаев слепоты, обусловленной сахарным диабетом, является первоочередной задачей в Европе (Декларация в St. Vincent). Авторы собрали данные о частоте случаев слепоты в популяции больных сахарным диабетом по сравнению с популяцией здоровых людей. До сих пор таких данных было очень мало.
      Собрали все случаи слепоты в общей популяции жителей Германии с 1990 по 1993 год, на основании которых пытались установить частоту и зависимость слепоты и сахарного диабета. В работе анализировали данные по 2714 пациентам; у 1823 (67,2%) – женщин и 781 (28,8%) мужчин был сахарный диабет. У 318 пациентов сахарный диабет являлся единственной причиной слепоты; у 192 пациентов диабет был лишь одной из причин слепоты. Возраст женщин составил 73,9+-19,4 года, мужчин 63,3+-25,5 лет. Результаты, стандартизированные по отношению к популяции Западной Германии, выглядят следующим образом:
      - частота случаев (на 100000 человека-лет) в общей популяции – 13,5;
      - в популяции больных сахарным диабетом – 60,6;
      - в популяции не больных сахарным диабетом – 11,6;
      - относительный риск – 5,2;
      - Характерный (абсолютный) риск среди больных сахарным диабетом – 0,81;
      - Характерный (абсолютный) риск в популяции – 0,14;
      Относительный риск значительно уменьшается с возрастом. Когда работу повторили с учетом критериев Декларации St. Vincent - обнаружили снижение показателей случаев слепоты в популяции больных сахарным диабетом на 17% с 95% уровнем достоверности.
      Вывод: Высокие относительные и абсолютные риски, особенно у молодых больных, требуют принятия превентивных мер против развития микрососудистых осложнений при сахарном диабете.